De plus en plus de matériaux synthétisés et étudiés sont à la frontière entre l’organique et l’inorganique, ce qui leur confère de nouvelles propriétés mais entraîne aussi de nouvelles difficultés pour les caractériser. En effet, la microstructure de ces nanomatériaux est de plus en plus complexe. Nous sommes obligés de développer de nouveaux outils pour être capable d’analyser et d’optimiser ces microstructures. D’autre part, la complexité des dispositifs nanométriques ne cessera de croitre jusqu’à obtenir des assemblages composés de plusieurs types de matériaux et dont l’ensemble est maintenu par toutes sortes d’interactions dont les plus faibles. Une technique de choix pour fournir des informations résolues dans les trois directions de l’espace sur ces structures complexes et sensibles est la Cryo-ET. Comme pour la tomographie classique, la reconstruction du volume s’effectue à partir d’une série de projections en deux dimensions (figure 1), la différence étant le fait que les projections sont enregistrées en mode Cryo-EM ; elle permet d’obtenir une résolution inferieure à la dizaine de nanomètres et même en deçà du nanomètre pour les plus résistants au faisceau d’électrons du microscope. Étant donné que la profondeur de champ en microscopie est assez grande et l’échantillon mince, la mise au point s’effectue en première approximation sur toute l’épaisseur de l’échantillon, surtout si l’on travaille en mode parallèle TEM. L’image obtenue est donc une projection de l’échantillon dans un plan perpendiculaire à la direction d’observation. En inclinant l’échantillon à l’aide du goniomètre du microscope à différents angles d’inclinaison (angles de tilt) et en réajustant à chaque reprise la mise au point de la projection, on obtient une série d’images de ce même objet. Puis à partir de cette série on peut réaliser une reconstruction 3D de l’objet à l’aide de différents algorithmes. La résolution finale dans le volume reconstruit dépend essentiellement du nombre de projections acquises et de l’angle de tilt maximum, mais également des caractéristiques de l’objet. Finalement l’analyse du volume consiste à visualiser et extraire les parties à analyser à et calculer les paramètres d’intérêt.
Défi pour le développement de Cryo-ET
La tomographie MET à froid (Cryo-ET) est une technique d’imagerie connue et très utilisée dans de nombreux sous-domaines de la biologie. Ceci grâce à sa capacité à imager des cellules intactes, des virus et de grands complexes moléculaires dans leur état quasi-natif d’hydratation congelée. Cette technique permet de combler l’écart de résolution entre les technologies d’imagerie à basse résolution, telles que la microscopie en fluorescence, et les technologies à haute résolution, telles que la cristallographie aux rayons X et la spectroscopie RMN. Grâce à ses particularités, la Cryo-ET a été largement utilisée pour révéler l’organisation moléculaire des structures cellulaires dans les cellules bactériennes et les virus. Par conséquent, la Cryo-ET est un outil idéal pour étudier ces structures presque intactes et leur relation avec leur environnement natif dans les reconstructions 3D (connues sous le nom de tomogrammes) à une résolution pouvant descendre jusqu’à 4 nm (même 2 nm dans les situations les plus favorables). Cependant, seuls les laboratoires de microscopie dédié aux matériaux biologiques pouvaient prétendre à ces caractéristiques grâce à leurs MET dédiés à la cryo-microscopie. Grace aux nombreux développements instrumentaux et méthodologiques, ils ont réussi à préparer et à acquérir presque de façon automatique des tomogrammes de leurs échantillons biologiques par congélation ultrarapide (inferieure à la milliseconde) sous très haute pression. Les échantillons vitrifiés peuvent être transférés dans le microscope à l’aide d’une cryo-canne sans jamais être en contact avec l’air ambiant. Les systèmes d’enregistrement de données sont très rapides et se font dans des espaces de stockage des données très volumineux. Dans notre laboratoire on ne dispose pas de toutes ces facilités, cependant nos matériaux d’études ne présentaient pas les mêmes caractéristiques que ceux issus de la biologie ; ce sont des matériaux hybrides, souvent hydratés, qui peuvent présenter une meilleure résistance aux dégâts d’irradiation et nous a permis d’explorer la matière hybride et fragile et d’en quantifier certains paramètres utiles. La seule différence entre une étude cryo-EM standard et une étude en Cryo-ET est le temps d’exposition. Pour l’acquisition des images 2D aux différents angles il faut au minimum 30 minutes. Souvent après les premières images, environ une dizaine, l’échantillon présente des signes de dégradation. A noter qu’en tomographie électronique standard ces effets de dégradation apparaissent plus rapidement dès la deuxième image et de façon bien plus importante. Nonobstant, plus nous progressons sur l’acquisition des images plus les dégâts sur la structure de la particule deviennent importants. Pour résoudre ce problème nous avons d’abord mesuré le dose d’électrons que peut supporter le matériau. Ensuite, nous avons mis en œuvre l’acquisition en respectant cette condition soit en jouant sur le temps d’acquisition soit en diminuant la dose d’électrons d’exposition par image selon plusieurs protocoles, qu’on détaillera par la suite. Pour finir, si malgré ces précautions notre échantillon présentait des dégâts nous utilisions des filtres lors de la reconstruction pour diminuer l’influence de ces dégats lorsqu’ils ne sont pas très importants, dans le sens qu’ils n’affectent que la surface et qu’ils ne modifient pas la morphologie générale de l’échantillon.
Cryo-Tomoographie 3D: quantification et détermination de la localisation des NPs dans un Réseau Métalo-Organique (MOF)
